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Diagnosi preimpianto

Diagnosi preimpianto

Presso il Centro AMBRA è possibile eseguire la diagnosi genetica preimpianto o PGT.

La normativa italiana (articolo 14, punto 5, legge 40/2004) prevede che le coppie che si sottopongono ad un ciclo di fecondazione in vitro possono richiedere di essere informate sullo stato di salute degli embrioni prodotti, prima di eseguire il trasferimento in utero. In questi casi, se vi sono le indicazioni, si può procedere con la diagnosi genetica preimpianto per identificare la presenza di malattie genetiche ereditarie (test PGT-M) o di alterazioni cromosomiche in fasi molto precoci dello sviluppo embrionale (test PGT-A e/o PGT-SR).

Le informazioni ottenute dal test PGT aiutano l’equipe e i pazienti IVF a decidere quali embrioni devono essere trasferiti. Per eseguire la diagnosi genetica preimpianto, il Centro AMBRA si avvale della collaborazione del laboratorio IGENOMIX ITALIA, quale centro specializzato di biologia e genetica molecolare per l’esecuzione di diagnosi genetiche molecolari. In linea generale, l’intera procedura consta di cinque fasi.

Nel Centro AMBRA hanno luogo le prime tre: fecondazione in vitro, biopsia embrionale e preparazione cellulare. Successivamente, le cellule bioptizzate verranno inviate a IGENOMIX, dove viene eseguita l’analisi genetica.

La crescita embrionale

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Fecondazione eterologa

Fecondazione eterologa

Con la sentenza 162/2014 la Corte Costituzionale, dichiarando illegittimo l’art.4 comma 3 della Legge 40/2004, ha rimosso il divieto di applicazione di tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita di tipo “eterologo”.

Quindi oggi in Italia le coppie che non hanno possibilità di concepire un figlio per mancanza di gameti competenti possono ricorrere alla donazione di gameti sia maschili (spermatozoi contenuti nel seme) che femminili (ovociti) anche contemporaneamente (doppia donazione). Al fine di garantire la tutela della salute dei riceventi e degli eventuali bambini che possano nascere, nei programmi di donazione la selezione dei donatori viene effettuata rispettando i criteri e le condizioni di qualità e sicurezza previsti dai D.Lgs 191/2007, 16/2010 e 85/2012, che attuano le Direttive Europee (n.2004/23/CE, 2006/17/CE e 2006/86/CE).

Infatti, i donatori sono sottoposti a specifici esami infettivologici, genetici; inoltre, vengono selezionati, previo accertamento di specifici requisiti soggettivi e caratteristiche fenotipiche, garantendo nei limiti del possibile la compatibilità delle principali caratteristiche fenotipiche del donatore con quelle della coppia ricevente (colore della pelle, occhi e capelli, gruppo sanguigno).

La fecondazione eterologa con donazione di spermatozoi può essere effettuata sia mediante tecniche di primo livello, come l’inseminazione intrauterina (IUI), che mediante tecniche di II livello, come la ICSI (Fecondazione in vitro).

La fecondazione eterologa con donazione di ovociti, o con donazione di ovociti e spermatozoi insieme, può essere effettuata mediante tecniche di II livello, come la FIVET/ICSI (Fecondazione in vitro).

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Servizio psicologico

Servizio psicologico

La coppia o la singola persona può usufruire di un supporto offerto dalla psicoterapeuta del Centro A.M.B.R.A, Dott.ssa Monica Bazzano.

PRIMO COLLOQUIO
Lo scopo del primo colloquio è quello di offrire ai pazienti la possibilità di raccontare il loro vissuto di coppia, comunicare gli eventuali dubbi, perplessità, paure ed ansie rispetto al percorso di PMA da affrontare. Inoltre, sempre su richiesta si può partecipare a sedute di “desensibilizzazione in vivo” presso il complesso operatorio per conoscere e familiarizzare con l’ambiente nel quale viene effettuato il prelievo ovocitario al fine di vivere bene e serenamente quel giorno.

PRESENZA DELLO PSICOTERAPEUTA IN SALA OPERATORIA DURANTE IL PRELIEVO OVOCITARIO
La presenza dello psicoterapeuta il giorno del prelievo ovocitario in sala operatoria ha lo scopo di indurre il rilassamento corporeo preanestesia al fine di ridurre la tensione muscolare ed i pensieri ansiogeni.

PRESENZA IN SALA OPERATORIA DURANTE IL TRASFERIMENTO DEGLI EMBRIONI:
Lo psicoterapeuta è presente in sala operatoria al momento del trasferimento degli embrioni, offre un supporto concreto sia prima che durante il trasferimento addestrando la paziente alla “visualizzazione”, una tecnica utile a ridurre l’ansia del momento.

CONSULENZA E SUPPORTO DOPO IL TRASFERIMENTO DEGLI EMBRIONI
I colloqui servono a ridurre lo stress associato all’attesa dell’esito del test di gravidanza e a proporre strategie utili per dislocare l’ansia che si sviluppa in queste giornate. 

CONSULENZA PSICOLOGICA AI PAZIENTI CHE RICORRONO ALLA DONAZIONE DI GAMETI.

CONSULENZE MIRATE
Per i pazienti che ne fanno richiesta, il servizio di psicologia è a disposizione per colloqui più strutturati, dove è possibile offrire una consulenza psicologica individuale o di coppia, avente i seguenti obiettivi:

  1. Riduzione dello stress attraverso la promozione di utili strategie di adattamento per affrontare in modo più funzionale le difficoltà che possono derivare dal problema dell’infertilità.
  2. Riduzione dei livelli di ansia attraverso l’apprendimento di specifiche strategie di coping.
  3. Mantenimento o recupero dell’armonia e della stabilità nel rapporto di coppia.

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Percorso della coppia

Percorso della coppia: fecondazione omologa

PERCORSO DELLA COPPIA

Primo incontro per difficoltà riproduttiva

Indicazioni alle tecniche di PMA

I livello

IUI – Inseminazione intrauterina

II livello

Il prelievo ovocitario

Inseminazione FIV-ICSI

Iniezione Introcitoplasmatica dello spermatozoo

Crescita embrionale

Trasferimento embrionale

Test di gravidanza

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Terapia dell’infertilità di coppia

Terapia dell’infertilità di coppia

Monitoraggio dell’ovulazione

Nella valutazione di base di una paziente sterile, lo studio dell’ovulazione rappresenta una tappa essenziale. L’accertamento di una regolare ovulazione deve essere effettuato in ogni paziente, anche se esiste una serie di patologie che si accompagnano quasi costantemente ad anovulazione e possono essere diagnosticate mediante altri esami ( es. dosaggi ormonali):

  • Anovulazione cronica da alterazioni dell’unità ipotalamo-ipofisi
  • Iperprolattinemia
  • Sindrome dell’ovaio policistico
  • Iper- o ipo-funzione surrenalica
  • Iper- o ipotiroidismo
  • Esaurimento ovarico precoce.

La diagnosi di ovulazione può essere posta mediante:

  • Determinazione quotidiana della temperatura basale (TB). La temperatura basale deve essere misurata correttamente, utilizzando sempre lo stesso termometro, a partire dal 1° giorno del ciclo mestruale, per via vaginale o rettale. L’avvenuta ovulazione è dimostrata da un innalzamento della temperatura corporea di 0,3-0,4 gradi, che si verifica in genere intorno al 14° giorno del ciclo; la successiva fase ipertermica è indicativa dell’attività del corpo luteo. Una curva termica ovulatoria è caratterizzata da: bifasicità, incremento termico di 0,3-0,4 gradi, fase ipertermica di 12-14 giorni.
  • Monitoraggio ecografico. Prevede controlli ecografici seriati a partire dal 8°-10° giorno del ciclo, così da evidenziare la presenza di un follicolo preovulatorio e, successivamente, la sua scomparsa e la presenza di una falda liquida a livello del cavo del Douglas, indicativa dell’avvenuto scoppio del follicolo stesso.
  • Biopsia endometriale. Deve essere eseguita in fase luteale tardiva mediante la tecnica della biopsia-aspirazione; l’evidenziazione di un endometrio di tipo secretivo sincrono con la fase del ciclo depone per una avvenuta ovulazione (Figura).
  • Dosaggio del progesterone. Si effettua un dosaggio plasmatico del progesterone in fase luteale; valori > 10 ng/l in genere indicano una avvenuta ovulazione.

Induzione della superovulazione

Lo scopo della stimolazione ovarica è di avere a disposizione un numero multiplo di ovociti al momento dell’inseminazione. I farmaci impiegati per l’induzione della superovulazione sono:

  • Citrato di clomifene
  • Gonadotropine menopausali umane
  • Gonadotropine ricombinanti.

Il meccanismo di azione di tali farmaci consiste nel mantenimento di livelli elevati di FSH nella fase follicolare precoce del ciclo, che permettono la selezione di follicoli multipli dalla coorte di follicoli in crescita, e, di conseguenza, una ovulazione multipla.

Il citrato di clomifene ha un effetto anti-estrogeno, ed inibisce in tal modo il feed-back negativo degli estrogeni sul rilascio ipofisario di gonadotropine; il suo effetto è pertanto l’incremento dei livelli di FSH durante la fase follicolare precoce del ciclo, che permette di salvare dall’atresia vari follicoli del pool dei follicoli in crescita. Un limite dell’impiego di tale farmaco è rappresentato dagli effetti potenzialmente avversi della sua azione anti-estrogenica su muco cervicale, endometrio e tube; inoltre il suo impiego appare associato ad un aumento del numero di aborti precoci, forse collegato al ridotto spessore endometriale, e del numero di gravidanze extrauterine, probabilmente dovuto all’alterata motilità tubarica. Tuttavia il citrato di clomifene ha il vantaggio di costi notevolmente ridotti e di una maggiore manegevolezza, nonché una migliore compliance da parte della paziente. Il citrato di clomifene può essere impiegato da solo o in associazione con le gonadotropine; in quest’ultimo caso, può esserci il vantaggio di ridurre la quantità di gonadotropine da somministrare per ottenere una stimolazione ottimale: il citrato di clomifene stimola infatti un aumento precoce di gonadotropine endogene, a cui si aggiungono successivamente le gonadotropine esogene.

Effetti collaterali talvolta legati all’uso di tale farmaco sono:

  • Vampate di calore
  • Alterazioni visive
  • Cefalea

Le gonadotropine menopausali sono gonadotropine estratte dalle urine di donne in post-menopausa e sottoposte a trattamento di purificazione; i composti inizialmente disponibili contenevano sia LH che FSH in eguali concentrazioni, e solo in un secondo momento si è ottenuto FSH puro.

Oggi in realtà i farmaci più impiegati sono rappresentati dalle gonadotropine ricombinanti, ottenute mediante metodiche di ingegneria genetica con tecnologia ricombinante, che, rispetto alle gonadotropine menopausali, sono dotate di una maggiore purezza, con conseguente minor rischio di reazioni allergiche, maggiore omogeneità dei lotti, maggiore attività specifica e maggiore contenuto proteico totale.

La somministrazione dei farmaci sopra elencati viene iniziata in fase follicolare precoce del ciclo, in genere al 2°-3° giorno, ad un dosaggio variabile in base alle caratteristiche della paziente; successivamente viene effettuato un monitoraggio ecografico, mediante ultrasonografia transvaginale, ed, eventualmente, ormonale, che permettono di valutare la risposta alla stimolazione ovarica e di modificare la terapia in base alle esigenze. Nel momento in cui viene evidenziata la presenza di almeno un follicolo preovulatorio di diametro >18 mm, si somministra la gonadotropina corionica o hCG, che induce l’ovulazione mediamente 36 –38 ore dopo la sua iniezione, e ci indica pertanto con relativa sicurezza il momento in cui eseguire l’IUI; in alternativa, si può attendere l’insorgenza del picco spontaneo dell’LH, programmando i rapporti 24-36 ore dopo il suo inizio.

In genere viene anche utilizzata una terapia di sostegno della fase luteale, nonostante non sia stata dimostrata la sua assoluta necessità con questo tipo di trattamento; tale terapia prevede la somministrazione di hCG o progesterone.

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IUI (Inseminazione intrauterina)

IUI

(Inseminazione intrauterina)

L’inseminazione intrauterina è una tecnica di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA) di I livello che viene impiegata nei casi di:

  • sterilità inspiegata
  • infertilità maschile di grado lieve
  • endometriosi di stadio 1 e 2
  • anovularietà
  • fattore psicologico
  • disfunzione erettile
  • eiaculazione retrograda
  • vaginismo

L’IUI può essere eseguita o durante un ciclo spontaneo o a seguito di induzione della crescita follicolare multipla. In quest’ultimo caso, la donna si sottoporrà ad un monitoraggio ormonale (tramite prelievo di sangue) e/o ecografico per seguire lo sviluppo follicolare.

Il giorno in cui viene programmata l’IUI, che corrisponde al momento dell’ovulazione, il campione seminale prodotto dal partner viene opportunamente processato allo scopo di selezionare gli spermatozoi mobili che rappresentano la frazione fertile del seme. Successivamente, tale frazione viene deposta nell’utero adoperando un catetere molto sottile e morbido.

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FIVET (Fecondazione in Vitro e Trasferimento dell’Embrione)

FIVET

(Fecondazione in Vitro e Trasferimento dell’Embrione)

La FIVET è una tecnica di PMA di II livello che trova le seguenti indicazioni:

  • patologia tubarica
  • fattore maschile di grado lieve o moderato
  • endometriosi
  • prematura riduzione della riserva ovarica
  • ripetuti fallimenti di inseminazioni intrauterine
  • fattore immunologico
  • infertilità idiopatica

La FIVET consiste nel prelievo degli ovociti dalle ovaie della donna, seguito dalla loro fertilizzazione in laboratorio con gli spermatozoi del marito e dal trasferimento in utero degli embrioni ottenuti “in vitro”.

A tal fine la donna viene sottoposta ad una terapia di preparazione (la cui durata è variabile: in media dai 10 ai 15 giorni) allo scopo di indurre una crescita follicolare multipla. Per seguire lo sviluppo follicolare, nel corso della terapia, vengono effettuati diversi controlli ecografici e prelievi ematici per dosare i livelli  ormonali. Quando i valori dell’estradiolo e le dimensioni follicolari indicano l’approssimarsi del momento ovulatorio, si procede  alla aspirazione ecoguidata dei follicoli per via transvaginale (in anestesia generale o in analgesia).

Gli ovociti recuperati dal liquido follicolare vengono quindi inseminati col seme del partner emesso lo stesso giorno del prelievo ovocitario ed opportunamente preparato.

Nello specifico, le procedure per la preparazione del liquido seminale prevedono una fase di lavaggio ed un periodo di incubazione del campione, al fine di ottenere un miglioramento della situazione seminale del paziente, inteso come aumento della concentrazione di spermatozoi mobili.

Iter di crescita degli embrioni umani

L’osservazione della avvenuta fecondazione dell’ovocita è il primo essenziale punto critico dell’iter di crescita degli embrioni umani. La valutazione dei pronuclei avviene tra le 16 e le 20 ore post-inseminazione e all’invertoscopio a massimo ingrandimento (almeno a 200x, preferibilmente a 400x). Si considera la fecondazione “normale” se sono presenti 2 pronuclei e 2 globuli polari, anche se quest’ultimi non sono sempre facilmente e singolarmente individuabili.

Gli embrioni così ottenuti vengono valutati e coltivati in vitro fino al momento del trasferimento in utero. I parametri che vengono presi in considerazione per la valutazione embrionaria comprendono:

  • Il numero e la grandezza delle cellule presenti nell’embrione
  • L’aspetto del citoplasma;
  • L’aspetto della zona pellucida;
  • La presenza di blastomeri plurinucleati.
  • presenza di frammentazioni anucleate nello spazio perivitellino dell’embrione

L’accurata valutazione degli embrioni svolge un ruolo diagnostico fondamentale nel trattamento FIVET e deve quindi essere considerata di primaria importanza, così come il mantenimento delle condizioni ottimali della coltura in vitro per lo sviluppo e crescita embrionale.

Il trasferimento embrionale può essere effettuato dal momento in cui si osserva la fecondazione (ovociti pronucleati o zigoti) fino a cinque-sei giorni dopo (blastocisti). Questa procedura non richiede alcun tipo di anestesia in quanto si tratta di una procedura molto semplice, indolore, che viene effettuata per via vaginale inserendo nel canale cervicale una cannula sottile in plastica che raggiunge la cavità uterina.

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ICSI (Iniezione Intracitoplasmatica dello Spermatozoo)

ICSI

(Iniezione Intracitoplasmatica dello Spermatozoo)

L’ICSI è una tecnica che consiste nella microiniezione di un singolo spermatozoo nel citoplasma di un ovocita maturo attraverso un sistema di micromanipolazione collegato ad un invertoscopio (microscopio) a forte ingrandimento. L’ICSI si può definire una variante della FIVET. Infatti, la donna viene sottoposta allo stesso tipo di trattamento della FIVET sia per quanto riguarda la stimolazione che per le fasi successive di aspirazione follicolare e di trasferimento in utero.

L’esecuzione dell’ICSI prevede le seguenti fasi:

  • Immobilizzazione dello spermatozoo tramite un microago e successiva aspirazione al suo interno;
  • Penetrazione del microago all’interno del citoplasma dell’ovocita;
  • Aspirazione del citoplasma dell’ovocita e successiva iniezione dello spermatozoo;
  • Rimozione del microago ad iniezione conclusa.

L’ICSI è una metodica che presenta molteplici indicazioni: infertilità maschile di grado severo, azoospermia (completa assenza di spermatozoi nell’eiaculato) ostruttiva e secretiva, mancata o ridotta fecondazione in precedenti cicli FIVET e ridotto numero di ovociti recuperati. Nei casi di azoospermia, quando la diagnosi andrologica lo consente, gli spermatozoi vengono recuperati dall’epididimo (PESA: aspirazione epididimale transcutanea di spermatozoi; MESA: aspirazione microchirurgica epididimale di spermatozoi) o dal testicolo (TESE: estrazione – biopsia – testicolare di spermatozoi; TESA: aspirazione testicolare di spermatozoi), ed utilizzati per la microiniezione.

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Crioconservazione di gameti ed embrioni

Crioconservazione di gameti ed embrioni

OVOCITI ED EMBRIONI
E’ possibile conservare mediante congelamento gli ovociti maturi prodotti in soprannumero. In conformità a quanto disposto dall’articolo 14 della legge n.40/2004, la crioconservazione degli embrioni è possibile:

  • nel caso in cui sussistano impedimenti imprevisti al trasferimento degli embrioni formati;
  • per consentire alla coppia l’ottenimento di una probabilità ottimale di successo;
  • per limitare i rischi correlati all’insorgenza di gravidanze multiple e alla ripetizione di cicli di stimolazione ovarica.

Nel nostro Laboratorio il congelamento degli ovociti e degli embrioni avviene mediante la tecnica di “vitrificazione” che ad oggi risulta essere quella più efficace. La vitrificazione è una tecnica di crioconservazione delle cellule in cui il raffreddamento avviene in modo estremamente rapido (-30.000 °C/min) sfruttando due aspetti chiave: l’immersione diretta delle cellule in azoto liquido (che è un gas atmosferico che, liquefatto, raggiunge la temperatura di 196 °C sotto lo zero) e l’utilizzo di elevate concentrazioni di sostanze crioprotettrici in minimi volumi. La possibilità di applicare tassi di raffreddamento elevatissimi evita la solidificazione della soluzione attraverso la formazione di uno stato “semi-solido” in cui gli ovociti e gli embrioni possono essere conservati in azoto liquido.

SPERMATOZOI
La crioconservazione degli spermatozoi è una tecnica volta a garantire il mantenimento del potenziale riproduttivo di un soggetto che in presenza di patologie neoplastiche deve sottoporsi a terapie (chirurgia, chemioterapia, radioterapia, etc.) che sono potenzialmente dannose alla produzione di spermatozoi nell’uomo. E’ noto che questo effetto però è variabile e dipende da tipo di trattamento terapeutico, dalla dose utilizzata, dall’età  del paziente e dal tipo di cancro. Questa tecnica può essere rivolta anche a pazienti che hanno una severa alterazione dei parametri del liquido seminale per garantire la conservazione degli spermatozoi in caso di peggioramento della capacità riproduttiva nel tempo. Inoltre, è prevista la crioconservazione del liquido seminale durante la fase di monitoraggio di un ciclo di PMA di I o II livello, se esistono motivi organizzativi della coppia che impongono tale scelta (ad esempio l’assenza nel giorno del prelievo ovocitario del partner per motivi di lavoro; oppure per motivi psicologici). La crioconservazione degli spermatozoi sfrutta la capacità che hanno queste cellule di sopravvivere al congelamento in azoto liquido, a – 196°C. Una volta scongelati, gli spermatozoi sono in grado di riprendere la loro funzione ed il loro movimento.

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